FISH

Τεχνικές υβριδισμού in situ. 

Fluoroscent in situ hybridization-FISH

Το FISH είναι μια διαδικασία που επιτρέπει στους ερευνητές να εντοπίσουν τις θέσεις των ειδικών αλληλουχιών DNA σε χρωμοσώματα.

Η FISH είναι μια σημαντική μοριακή κυτταρογενετική μέθοδος για την ταυτοποίηση χρωμοσωμάτων και τμημάτων των χρωμοσωμάτων, για τις αναδιατάξεις χρωμοσωμάτων, την αποκρυπτογράφηση και τον εντοπισμό γονιδίων στα χρωμοσώματα.

Οι τεχνικές του υβριδισμού in situ έχουν σαν χαρακτηριστικό τους ότι το DNA ή το RNA στόχος ανιχνεύονται κατ' ευθείαν στον ακέραιο ιστό, στο κύτταρο ή στο χρωμόσωμα. Όταν αναδιαταχθεί το DNA και χωρίσουν οι δύο αλυσίδες, υπάρχει τάση για επανασύνδεση και σχηματισμό του αρχικού μορίου. Στην περίπτωση που συνυπάρχουν διάφορα μόρια ή τμήματα DNA, η ακρίβεια της επανασύνδεσης εξαρτάται από τις συνθήκες υβριδισμού.

Ελαστικές συνθήκες μπορεί να οδηγήσουν σε λανθασμένο ζευγάρωμα, ενώ οι πλέον κατάλληλες συνθήκες μπορεί να οδηγήσουν σε ζευγάρωμα αλυσίδων αυστηρά συμπληρωματικών. Βάσει αυτής της ιδιότητας, ο ανιχνευτής θα σχηματίσει ένα υβριδικό μόριο με την αλληλουχία στόχο, η οποία βρίσκεται στη βιολογική δομή που μελετούμε. 

Ο ανιχνευτής είναι κατάλληλα σημασμένος σε κάποιο μόριο, όπως βιοτίνη, διγοξιγενίνη ή fluorescein το οποίο επιτρέπει την ανίχνευση του σημείου υβριδισμού.

Το  DNA στόχος μονιμοποιείται και αναδιατάσσεται. Ο σημασμένος ανιχνευτής βρίσκεται σε ειδικό διάλυμα υβριδισμού και ανταγωνιστικού DNA το οποίο αναδιατάσσεται και στη συνέχεια επωάζεται με μη ειδικές αλληλουχίες ανιχνευτού. Στη συνέχεια τοποθετείται στο DNA στόχο και ακολουθεί επώαση.

Μετά τον υβριδισμό η περίσσεια ανιχνευτή απομακρύνεται με κατάλληλα πλυσίματα που στοχεύουν στην διάσπαση τυχόν ασταθών υβριδικών μορίων που έχουν σχηματισθεί. Ακολουθούν διαδοχικά στάδια προσθήκης φθοριοχρωμάτων και έκπλυσης σε κατάλληλα διαλύματα και παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού.

"Fluorescent" σημαίνει εκπομπή φωτός που προέρχεται από μία αντίδραση εντός του εκπομπού.

" in situ " αναφέρεται στο γεγονός, ότι αυτό γίνεται με τεχνικές σε κύτταρα, στα χρωμοσώματα, ή σε ιστό στη θέση (in situ) αυτή, σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου.

Η in situ υβριδοποίηση είναι μια τεχνική στην οποία τα μονοκλωνικά νουκλεϊκά οξέα (DNA ή RNA) επιτρέπεται να αλληλεπιδρούν, έτσι ώστε σύμπλοκα, ή υβρίδια, που σχηματίζονται από συμπληρωματικές αλληλουχίες. 

Μέσω υβριδοποίησης νουκλεϊκού οξέος, ο βαθμός ταυτότητας αλληλουχίας μπορεί να προσδιορίζεται και να ανιχνεύονται ειδικές αλληλουχίες και ενίοτε οι αλληλουχίες που μπορούν να βρίσκονται σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα. 

Ένα νουκλεϊκό οξύ επισημασμένο με μια φθορίζουσα χρωστική υβριδοποιείται σε κατάλληλα παρασκευασμένα κύτταρα ή ιστολογικές τομές. Αυτό χρησιμοποιείται, κυρίως, για ανίχνευση ειδική μεταγραφής  ή εντοπισμό των γονιδίων σε συγκεκριμένα χρωμοσώματα.

Ιστορικά, το FISH έπαιξε πρωταρχικό ρόλο στην χαρτογράφηση γονιδίων σε ανθρώπινα χρωμοσώματα. Τα αποτελέσματα από τα πειράματα αυτά συλλέχθηκαν και συγκεντρώθηκαν σε βάσεις δεδομένων και χαρτογραφήθηκε το ανθρώπινο γονιδίωμα (HGP). 

Τώρα που το ανθρώπινο γονιδίωμα είναι πλήρες, οι ερευνητές χρησιμοποιούν σπάνια τον in situ υβριδισμό απλά για να προσδιορίσουν την χρωμοσωμική θέση του ανθρώπινου γονιδίου. (Σε είδη για τα οποία το γονιδίωμα δεν έχει αλληλουχηθεί, ωστόσο, το FISH και οι μεθόδοι in situ υβριδισμού συνεχίζουν να παρέχουν σημαντικά στοιχεία για τη χαρτογράφηση των θέσεων των γονιδίων στα χρωμοσώματα. Σήμερα, οι ανθρώπινες εφαρμογές FISH, κυρίως, κατευθύνονται προς κλινικές διαγνώσεις.

Η διάγνωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών 

Χρησιμοποιώντας καρυότυπο και FISH και άλλες in situ διαδικασίες υβριδισμού γίνεται κλινική διάγνωση των διαφόρων χρωμοσωμικών ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων των διαγραφών, διπλασιασμών, και μετατοπίσεων.

Πρόσθετες εφαρμογές του FISH στην Κλινική Πράξη και το Εργαστήριο

Συναρπαστικές νέες εφαρμογές του FISH συνεχίζουν να αναπτύσσονται. Για παράδειγμα, γίνεται κυτταρογενετική συγκριτική γενομική υβριδισμού για την ανίχνευση ποσοτικών διαφορών, όπως παραλλαγές αριθμού αντιγράφων, στα χρωμοσώματα των ασθενών. 

Πρόσφατα, οι ερευνητές έχουν, επίσης, τη δυνατότητα να αυξήσουν την ανάλυση της FISH με χρήση τεντωμένων ινών χρωματίνης  ή microarrays ως στόχο. Με εργαλεία όπως αυτά, η κυτταρογενετική είναι σε θέση να μετακινηθεί από τη μελέτη ολόκληρων χρωμοσώματων στη μελέτη του DNA από το οποίο αποτελούνται τα χρωμοσώματα.

Βιβλιογραφία

BAC Resource Consortium. Integration of cytogenetic landmarks into the draft sequence of the human genome. Nature 409, 953–958 (2001) 

Speicher, M. R., & Carter, N. P. The new cytogenetics: Blurring the boundaries with molecular biology. Nature Reviews Genetics 6, 782–792 (2005)

Trask, B. J. Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and counting. Nature Reviews Genetics 3, 769–778 (2002) 

Watson, J. D., & Crick, F. H. C. Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171, 737–738 (1953)